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超微量紫外可见分光光度计常用于哪些方面?

发表时间:2021-06-18  |  点击率:217
超微量紫外可见分光光度计是通过检测物质波长处或某一波长范畴内光的吸收度,对物质进行定量与定量分析的仪器设备,目前已成为现代分子生物学、药物学、食品科学等领域的常用仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。  

1、核酸的定量  
核酸的定量是超微量分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。
分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化都是正常的,即仪器有一定的准确度和精确度。影响吸光值A的几个因素如下:  
(1)核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液。  
(2)样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了尽可能减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范  
(3)操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。  

2、核酸的纯度检测  
除了核酸浓度,超微量分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如:  
(1)A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。  
(2)A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。  
(3)A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。  

3、蛋白质直接定量  
这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。超微量分光光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320nm的"背景"信息,设定此功能"开"。与测试核酸类似,要求A280的吸光值大于0.1A,最佳的线性范围在1.0-1.5之间。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。  

4、比色法蛋白质定量(颜色反应)  
蛋白质比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。  
比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等几种方法。  
由于各种方法反应的基团以及显色基团不一,所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。所以在选择比色法之前,最好是参照要测试的样本的化学构成,寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。  
比色法定量蛋白质,经常出现的问题是样品的吸光值太低,导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。因为比色皿中的颜色是有一定的半衰期,所以每种比色法都列出了反应测试时间,所有的样品(包括标准样品),都必须在此时间内测试。时间过长,得到的吸光值变小,换算的浓度值降低。反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色皿,因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色,导致样品吸光值不准确。  

5、OD600(菌落密度)  
实验室确定细菌生长密度和生长期,多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验,需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。通过检测600nm处细胞生长培养的吸光度,从而监测微生物或其他细胞培养的生长率。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值,原因是采用了显色的培养基,即细菌培养一段时间后,与培养基反应,发生变色反应。

 
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