退火温度是PCR反应中的重要影响因素

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的的技术，通过多个循环的变性、退火和延伸，能够使微量的遗传物质在几小时内得到几百万倍的扩增。其基本过程为变性、退火和延伸，这三步需要不同的温度条件。

那么，怎样确定退火温度？
 

    退火温度主要取决于引物的碱基组成、长度和浓度。而合适的退火温度对PCR反应的特异性尤为关键。一般来说，退火温度的高低影响同时影响PCR反应的特异性和灵敏性（扩增效率），且两者呈负相关，即较低的退火温度可提高PCR反应的灵敏性但其特异性较差，而较高的退火温度则可以提高反应的特异性但却降低了其扩增效率。

 

    通常，在Tm值允许范围内选择偏高的退火温度以提高PCR反应的特异性。当然，实际的退火温度还是要以对应的PCR反应的要求做出调整。

 

    事实上，根据退火温度的文字性定义可以看出，退火温度的设定与引物的Tm值(熔解温度)有一定的关系。因此大多数童鞋在设定退火温度时，会以两条引物中较低的Tm值再减去5℃。

 

    而对于Tm值的确定，又是一个问题。商品化的引物会有一个建议的Tm值，而自己合成的Tm值需要进行计算，可以通过引物设计软件（primer premier 5.0，Oligo 6.22等）或在线的引物设计网站进行Tm值的确定。但由于计算方法的不同，同样一段引物在不同引物设计软件或网站得到的Tm值有所差别。

 

    种种以上，我们不难看出一个合适的退火温度并不好确定。因此，优化退火温度理想的方法是设置一系列的对照反应，即通过在低于计算出的引物Tm值2~10℃的温度范围内进行退火的一系列平行反应来确定退火温度。