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退火温度是PCR反应中的重要影响因素

发表时间:2021-08-03  |  点击率:1482
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的的技术,通过多个循环的变性、退火和延伸,能够使微量的遗传物质在几小时内得到几百万倍的扩增。其基本过程为变性、退火和延伸,这三步需要不同的温度条件。

那么,怎样确定退火温度?
 
    退火温度主要取决于引物的碱基组成、长度和浓度。而合适的退火温度对PCR反应的特异性尤为关键。一般来说,退火温度的高低影响同时影响PCR反应的特异性和灵敏性(扩增效率),且两者呈负相关,即较低的退火温度可提高PCR反应的灵敏性但其特异性较差,而较高的退火温度则可以提高反应的特异性但却降低了其扩增效率。
 
    通常,在Tm值允许范围内选择偏高的退火温度以提高PCR反应的特异性。当然,实际的退火温度还是要以对应的PCR反应的要求做出调整。
 
    事实上,根据退火温度的文字性定义可以看出,退火温度的设定与引物的Tm值(熔解温度)有一定的关系。因此大多数童鞋在设定退火温度时,会以两条引物中较低的Tm值再减去5℃。
 
    而对于Tm值的确定,又是一个问题。商品化的引物会有一个建议的Tm值,而自己合成的Tm值需要进行计算,可以通过引物设计软件(primer premier 5.0,Oligo 6.22等)或在线的引物设计网站进行Tm值的确定。但由于计算方法的不同,同样一段引物在不同引物设计软件或网站得到的Tm值有所差别。
 
    种种以上,我们不难看出一个合适的退火温度并不好确定。因此,优化退火温度理想的方法是设置一系列的对照反应,即通过在低于计算出的引物Tm值2~10℃的温度范围内进行退火的一系列平行反应来确定最佳退火温度。
 

     温度梯度PCR仪是在普通PCR仪基础上带有设置温度梯度功能的PCR仪,梯度PCR仪除具有普通PCR仪的结构外,还具有特殊的梯度模块,可实现对梯度温度和梯度时间等参数的调整。因此可以在一次实验中对不同样品设置不同的退火温度和退火时间,从而可在短时间内对PCR实验条件进行优化,提高PCR科研效率。

 

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